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Freitag, 19 März 2021 10:59

Offener 3D-Druckstandard für die Mikroskopie - Teil 2 - Konzept und Aufbau

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Geschätzte Lesezeit: 13 - 25 Minuten

Moderne Mikroskope für biologische Bildgebung sind oft „Black Boxes“, deren genaues Funktionsprinzip unbekannt bleibt und deren optische Auflösung und Preis umgekehrt proportional zueinander zu sein scheinen. Mit UC2 (You. See. Too.) wird hier ein kostengünstiger, 3D-gedruckter, quelloffener, modularer Mikroskopie-Baukasten präsentiert und seine Vielfältigkeit demonstriert, indem ein kompletter Mikroskop-Entwicklungszyklus vom Konzept bis zur experimentellen Phase realisiert wurde.

Einleitung

Das in einen Inkubator eingeschlossene Hellfeld- mikroskop überwacht sieben Tage lang die Differenzierung von Monozyten- zu Makrophagenzellen auf zellulärer Auflösungsebene (z.B. 2 μm). Darüber hinaus wird die Geometrie durch die Einbeziehung sehr weniger Zusatzkomponenten in ein 400-Euro-Lichtblattfluoreszenzmikroskop für volumetrische Beobachtungen eines transgenen Zebrafisches übertragen, der grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert. Damit will man einen offenen Standard in der Optik etablieren, um die Kopplung mit verschiedenen komplementären Plattformen zu erleichtern. Indem Inhalt und umfassende Dokumentation öffentlich zugänglich gemacht werden, eignen sich die hier vorgestellten Systeme für einfache und unkomplizierte Replikationen, Modifikationen und Erweiterungen.

Lehrreich: Lichtblattmikroskop für den Bildungsbereich

In diesem Abschnitt wird die Vielseitigkeit demonstriert, indem das BF-System des vorigen Kapitels in ein Licht- schnittmikroskop (Abb. 2g) umgewandelt wird, indem das LED-Array gegen einen Laserpointer ausgetauscht, ein zweites Mikroskop-Objektiv, einen Strahlaufweiter, eine Zylinderlinse und den Probentisch unter Verwendung einer größeren Grundplatte hinzugefügt wird. Ein Video, das die Konvertierung zusammen mit einem detaillierten Konvertierungsrezept und einem detaillierten Schema des offenen SPIM-inspirierten [15] Aufbaus erklärt, ist im Ergänzungsvideo 4 bzw. in den Ergänzenden Anmerkungen 7.7 zu finden. Erworben wurde ein 3D-Datenstapel von Zebrafischlarven, die GFP in den Blutgefäßen exprimieren, der mit dem Programm „GenericDeconvolution“ von Heintzmann et al. (auf Anfrage erhältlich) weiter driftkorrigiert und entfaltet wurde (Abb. 3l, Ergänzende Abb. 3) . Im Moment zeigen die Ergebnisse lediglich einen Proof of Concept, dass es möglich ist, ein Lichtblattsystem zu einem so niedrigen Preis (400 Euro) zu bauen. Für eine bessere Leistung wären bessere optische Komponenten und eine bessere Anpassung an die Anwendungen notwendig. Das Lichtblattmikroskop hat jedoch seine Nützlichkeit in der Lehre bewiesen und den Anwendern einen wertvollen Einblick in eine Methode gegeben, mit der sie häufig arbeiten, die sie aber nur als Black Box kennen. Man analysierte die erforderliche Mindestanzahl gedruckter und handelsüblicher Komponenten, um die zuvor erwähnten Aufbauten sowie Teleskope, Projektoren, Abbe-Beugungsexperimente oder holographische (z. B. linsenlose) Bildge- bungsgeräte kosten- und ressourcensparend zu bauen, um eine druckfertige Sammlung von Teilen und Dokumentationen mit dem Namen „TheBOX“ (siehe ergänzende Anmerkungen 7.11) und eine für Mikroskopie-Lehrkurse optimierte Version „CourseBOX“ zusammenzustellen. Unterstützt wird sie durch eine ständig verbesserte Dokumentation mit Schritt-für-Schritt-Anleitungen und Tutorials. Getestet wurde das System bei verschiedenen Kon- ferenzen, Workshops und Lehrumgebungen (siehe ergänzende Anmerkungen 9) und zahlreiche konstruktive Rückmeldungen zur weiteren Verbesserung des Systems wurden gegeben. Man konnte während dieser Iterationen eine geringere Nutzungs- und Verständnisbarriere für neue Workshop-Teilnehmer feststellen, was auf die Verbesserung der Dokumentation und die stetig zunehmende Robustheit der Cubes zurückzuführen ist.

Abb. 2: Rapid Prototyping mit UC2. Üblicher Arbeitsablauf zur Erstellung einer UC2-Anwendung: (a) Beginnend mit einer biologischen Fragestellung/Idee, für die ein bildgebendes Gerät benötigt wird, das in (b) entworfen (invertiertes Inkubatormikros-kop) und in (c) mit UC2-Komponenten aus der CAD-Bibliothek umgesetzt wird. Nach dem Druck und Zusammenbau (d) wird das Gerät in seine Arbeitsumgebung (z.B. Inkubator) gestellt (e) und ist bereit, Langzeit-Bildserien von z.B. MDCK-Zellen aufzunehmen, die in (i) und im ergänzenden Video 6 visualisiert werden. Die Fernsteuerung erfolgt über „smarte Komponenten“ (z.B. Mobiltelefon, Raspberry Pi) in (h). Die Wiederverwendung von Komponenten erlaubt den Umbau in ein Handy-Mikroskop (f) oder Lichtblattmikroskop (g) innerhalb von Minuten (siehe Ergänzungsvideo 5) und Ergänzende Hinweise 7.8). CL: Zylinderlinse, TL: Tubuslinse, L: Laser, LA: LED-Array, M: Spiegel, MO: Mikroskopobjektiv, P-CAM: Detektor (Smartphone oder Raspberry Pi), S: Probenpositioniertisch, F: Emissionsfilter, Z: FokussiertischAbb. 2: Rapid Prototyping mit UC2. Üblicher Arbeitsablauf zur Erstellung einer UC2-Anwendung: (a) Beginnend mit einer biologischen Fragestellung/Idee, für die ein bildgebendes Gerät benötigt wird, das in (b) entworfen (invertiertes Inkubatormikros-kop) und in (c) mit UC2-Komponenten aus der CAD-Bibliothek umgesetzt wird. Nach dem Druck und Zusammenbau (d) wird das Gerät in seine Arbeitsumgebung (z.B. Inkubator) gestellt (e) und ist bereit, Langzeit-Bildserien von z.B. MDCK-Zellen aufzunehmen, die in (i) und im ergänzenden Video 6 visualisiert werden. Die Fernsteuerung erfolgt über „smarte Komponenten“ (z.B. Mobiltelefon, Raspberry Pi) in (h). Die Wiederverwendung von Komponenten erlaubt den Umbau in ein Handy-Mikroskop (f) oder Lichtblattmikroskop (g) innerhalb von Minuten (siehe Ergänzungsvideo 5) und Ergänzende Hinweise 7.8). CL: Zylinderlinse, TL: Tubuslinse, L: Laser, LA: LED-Array, M: Spiegel, MO: Mikroskopobjektiv, P-CAM: Detektor (Smartphone oder Raspberry Pi), S: Probenpositioniertisch, F: Emissionsfilter, Z: Fokussiertisch

Multimodal: Fluoreszenz und markierungsfreie Bildgebung

Obwohl gezeigt konnte, dass Fluoreszenz-Imaging mit der UC2-Inkubator- und Lichtschnitt-Konfiguration möglich ist (z.B. Fluoreszenz-Overlay in Abb. 3c), litt die Empfindlichkeit der Raspberry Pi-Kamera unter dem hohen Rauschbeitrag, in den Ergänzenden Anmerkungen 7.5 quantifiziert, und der reduzierten Empfindlichkeit aufgrund des Bayer-Musters. Das Ersetzen der RGB-Kamera Raspberry Pi durch ein Mobiltelefon mit einer hintergrundbeleuchteten monochromatischen Kamera (P20 Pro, Huawei, China), die bis zu 4 × mehr Photonen einfängt, verbesserte die Abbildungsleistung erheblich. Ein quantitativer Vergleich wurde durch Aufnahme von mCLING-ATTO 647N (SYSY, Deutschland), das mit E. coli markiert ist, unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit unendlicher Optik auf UC2-Laserbasis (×100, NA = 1,25 Öl, λexc = 635/637 nm, siehe ergänzende Anmerkungen 7.4, das mit einer Raspberry Pi-Kamera oder einer Mobiltelefonkamera ausgestattet ist, mit einem Standard-Forschungsmikroskop (Zeiss Axiovert TV, ×100, NA = 1,46) in Abb. 3i-k erzielt. Die Handykamera konnte die Plasmamembran der Bakterien deutlich auflösen (siehe Abb. 3i-k, kleine Sub-ROI). Ermitteltet wurde die praktische Auflösung dcellphone = 0,6 μm im Vergleich zu dRaspi = 1,13 μm und dZeiss = 0,27 μm, bei ähnlichen experimentellen Bedingungen (z. B. Belichtungszeit, Verstärkung, Laserintensität) unter Verwendung der Fourier-Ring-Korrelation (FRC) [38] (weiter quantifiziert in den ergänzenden Anmerkungen 7.4). Unter Verwendung der GUI auf der Raspberry Pi konnte ferner eine Zeitrafferreihe von sich bewegenden fixierten, aber mobilen (z. B. in wässriger Suspension) E. coli-Bakterien bei 1 fps unter Verwendung des zuvor erwähnten unendlich-korrigierten Aufbaus geplant werden (siehe ergänzendes Video 7)

UC2 ermöglicht auch die Konzeptionierung anspruchsvollerer Systeme. Als Beispiel die Herstellung eines Image Scanning mikroskops (ISM) [39], bei dem man den Anregungslaser in der früheren unendlich-korrigierten Anordnung durch ein kundenspezifisches Modul ersetzte, das einen Laserscanning-Videoprojektor (Sony MP.CL1A, Japan; ergänzende Anmerkungen 7.9) beinhaltet. Man vergleicht Bilder von GFP-markierten humanen pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen (HPMEC), die mit dem UC2-ISM (Optika, × 20, NA = 0,4, N-Plan, weitere Informationen ergänzende Anmerkungen 7.9 ) aufgenommen wurden, mit einem hochmodernen Laser-Scanning-Konfokalmikroskop (Leica TCS SP5, Fluotar × 20, NA = 0,5, Deutschland) in Abb. 3e-h. Das rechnerisch rekonstruierte „superkonfokale“ Bild [40] Abb. 3g zeigt einen optischen Schnitt im Vergleich zum Weitfeldäquivalent Abb. 3f

Abb. 3: Visualisierung der verschiedenen Bildgebungsmodalitäten aus einem UC2-Aufbau Variation der Makrophagenmorphologie In a)-b), sind nach 42 h deutlich verlängerte Zellen zu sehen (roter Pfeil). Das Wachstum einer differenzierenden Zelle ist als durchschnittliche Fläche der Zellen über mehrere Zeitschritte und verschiedene Experimente in d) dargestellt. c) Der Hellfeldkanal überlagert mit einem Fluoreszenzsignal von fixierten, mit CellTracker green markierten Makrophagen, aufgenommen mit dem Mikroskop im Inkubator. e) Weitfeld-Fluoreszenz und f) das berechnete „superkonfokale“ Ergebnis von GFP-markierten HPMECs, beleuchtet mit einem Laser-Scanning-Projektor, aufgenommen mit einer Handykamera. Die herangezoomten Bilder zeigen die Verbesserung des optischen Schnitts bei strukturierter Beleuchtung in h) im Vergleich zum Weitwinkel in g), bei dem kleinere Zellstrukturen verloren gehen. i) Ein Vergleich der gleichen Probe, aufgenommen mit einem kommerziellen Laser-Scanning-Konfokalmikroskop. j) Ein aufgenommener z-Stapel einer GFP-exprimierenden Drosophila-Larve. k) Die Verwendung eines LED-Rings als Beleuchtung ermöglicht die quantitative Phasenabbildung von Wangenzellen mit A-IDT. l) LED-Matrizen können schnell zwischen Hell- und Dunkelfeldabbildung umschalten, wie in l) gezeigtAbb. 3: Visualisierung der verschiedenen Bildgebungsmodalitäten aus einem UC2-Aufbau Variation der Makrophagenmorphologie In a)-b), sind nach 42 h deutlich verlängerte Zellen zu sehen (roter Pfeil). Das Wachstum einer differenzierenden Zelle ist als durchschnittliche Fläche der Zellen über mehrere Zeitschritte und verschiedene Experimente in d) dargestellt. c) Der Hellfeldkanal überlagert mit einem Fluoreszenzsignal von fixierten, mit CellTracker green markierten Makrophagen, aufgenommen mit dem Mikroskop im Inkubator. e) Weitfeld-Fluoreszenz und f) das berechnete „superkonfokale“ Ergebnis von GFP-markierten HPMECs, beleuchtet mit einem Laser-Scanning-Projektor, aufgenommen mit einer Handykamera. Die herangezoomten Bilder zeigen die Verbesserung des optischen Schnitts bei strukturierter Beleuchtung in h) im Vergleich zum Weitwinkel in g), bei dem kleinere Zellstrukturen verloren gehen. i) Ein Vergleich der gleichen Probe, aufgenommen mit einem kommerziellen Laser-Scanning-Konfokalmikroskop. j) Ein aufgenommener z-Stapel einer GFP-exprimierenden Drosophila-Larve. k) Die Verwendung eines LED-Rings als Beleuchtung ermöglicht die quantitative Phasenabbildung von Wangenzellen mit A-IDT. l) LED-Matrizen können schnell zwischen Hell- und Dunkelfeldabbildung umschalten, wie in l) gezeigt

Weiterhin sind bei Verwendung einer LED-Matrix (Adafruit #1487, NY, USA) als Lichtquelle im Transmissionsmodus die Auswahl der Beleuchtungswellenlänge, bestimmte Muster zur Kontrastmaximierung [41] unter Verwendung des openKöhler-Moduls (ergänzende Anmerkungen 7.10), Dunkelfeldbeleuchtung (Abb. 3n) oder quantitative Phasenmethoden wie „(quantitativer) differentieller Phasenkontrast“ (qDPC26, siehe ergänzende Anmerkungen 7.6) und „Fourier-Ptychographie-Mikroskopie“ (FPM [42]) einfach. Man ersetzte die Matrix durch einen LED-Ring (Adafruit#1463), um die rechnerische Refokussierung einer wiederhergestellten Phasenkarte von Wangenzellen (Abb. 3m) zu demonstrieren, um die „Ringförmige Intensitätsbeugungstomographie“ (aIDT [43], siehe auch die ergänzenden Anmerkungen 7.6 und den rekonstruierten Z-Stapel im Ergänzungsvideo 3) anzuwenden.

Diskussion

In dieser Arbeit wurde ein modularer Mikroskop-Baukasten vorgestellt, der das Potenzial hat, als wirklich offener Standard zu dienen. Dieser Standard wird durch die Abmessungen und die Form des Basiswürfels auf der Grundlage einer Vielzahl von Parametern und Erfahrungen definiert, um so allgemein wie möglich zu sein. Das Ziel, nicht nur neue Teile zu schaffen, sondern eine gemeinsame Schnittstelle für die ständig wachsende Vielfalt unterschiedlicher Komponenten zu definieren, wurde erreicht. Indem man UC2 auch mit bestehenden Schienen- und Käfigystemen von Thorlabs, Newport, Edmund Scientific und dergleichen sowie mit bestehenden Laborgeräten verbindet, erleichtert man den Benutzern den Einstieg in die Verbindung und Wiederverwendung bestehender Komponenten und Aufbauten und stärkt damit die Idee als offenen Standard.

Man demonstrierte die inhärente Vielseitigkeit der UC2-Toolbox, indem zunächst ein ganzer Lebenszyklus eines Mikroskops in wenigen Schritten für eine Inkubator-umschlossene Hellfeldkonfiguration realisiert und dann Beispiele dafür vorgestellt wurden, wie durch den Austausch einiger weniger Komponenten verschiedene moderne mikroskopische Techniken umgesetzt werden können.

Aber natürlich gibt es auch Grenzen hinsichtlich der Langzeitstabilität von 3D-gedruckten Aufbauten, die auf die temperaturabhängig verformbaren PLA- und ABS-Materialien zurückzuführen sind. Der iterative Designprozess führte zu einem austauschbaren mechanischen Modul mit minimaler Biegung, das durch eine Autofokus-Routine oder manuelle Nachfokussierung aktiv unterstützt werden kann. Dies ermöglichte es, eine Langzeitstabilität in mehreren Experimenten zu erreichen, bei denen die Bildgebung mit 4 Inkubator-umschlossenen Mikroskopen über 7 Tage ohne nennenswerte Fokusdrift erfolgte, wobei die In-vitro-Makrophagendifferenzierung kontinuierlich beobachtet wurde. Die Möglichkeit von Langzeitmessungen erlaubte uns die Replikation der von Xia et al. [37] veröffentlichten Daten, bei denen die längliche Form der Makrophagen mit ihrer Bewegung korreliert ist. Das inkubatorintegrierte Mikroskop bewies die Vorteile seiner inhärent kleinen Stellfläche und hohen Durchsatzfähigkeit, indem es Experimente mit sehr geringem Budget parallelisierte und gleichzeitig maßgeschneiderte Bildgebungswerkzeuge für z.B. mikrofluidische Chips oder innerhalb hochsicherer biologischer Umgebungen (BSL3+) bereitstellte.

Ein weiterer wichtiger limitierender Faktor bei der Fluoreszenz-Bildgebung (z. B. Light-Sheet-Aufbau) ist die Leistung der verwendeten Raspberry Pi-Kamera (v2.1), die mit empfindlicheren Kamerasensoren, z.B. von Mobiltelefonen oder Industriekameras, verbessert werden kann. Daher ist das Lichtblattsystem eher ein kostengünstiger (≈400 Euro) Proof-of-Concept-Ansatz, der einen wertvollen Einblick in die Methode für Anwender im Lehrbereich bietet, als ein produktives Bildgebungswerkzeug zu sein.

Mit „TheBox“ wurde ein ausgeklügeltes Toolset für Lehrzwecke eingeführt. Zusammen mit einer Reihe von gebrauchsfertigen Dokumentationen, optischen Konzepten (Interferenz, Bildentstehung, etc.) und einer Vielzahl von Lichtmikroskopie-Methoden stellte man eine offen zugängliche mikroskopische Plattform zu einem Preis zwischen 100 und 600 Euro zur Verfügung. Dies gibt Studenten und Endnutzern die Möglichkeit, zu erfahren, wie moderne optische Methoden funktionieren, und fördert interdisziplinäre Ansätze, bei denen mehrere Lehrthemen gleichzeitig behandelt werden. Beispielhaftes Lehrmaterial ist in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt.

Die UC2-Toolbox kann aufgrund ihrer inhärenten Modularität sowohl auf der Hardware- als auch auf der Softwareseite leicht in bestehende Frameworks wie Openflexure stage [16], Micro-manager [44] und ImJoy [42] integriert werden. Darüber hinaus ermöglicht der vorhandene Pool an einsatzbereiten Modulen ein schnelles Prototyping in der Optik, in der Lehre und in anderen Bereichen. In der Optik wird ein vielseitiges, flexibles, erweiterbares Enabling-Tool dringend benötigt. Mit UC2 hoffen die Wissenschaftler, ein optisches Äquivalent zu dem zu schaffen, was Arduino für die Elektronik und Fidschi [46] für die Bildverarbeitung biomedizinischer Daten darstellt, indem modernste mikroskopische Techniken für jedermann zugänglich gemacht werden. Man bemühte sich, den Reproduktionsschwierigkeiten entgegenzuwirken, indem Schritt-für-Schritt-Protokolle auf der Hardware-Ebene zur Verfügung gestellt werden, um Experimente direkt nachvollziehen zu können. Man glaubt, dass die angesprochene Gemeinschaft die UC2-Toolbox als echter offener Standard aufgegriffen und damit die einfachere Verbreitung von Laborforschung und Rapid System Prototyping nicht nur in der Forschung, sondern auch in der Lehre unterstützt wird.

Methoden Herstellung der Komponenten und Auswahl von Zusatzteilen für das inkubatorintegrierte Mikroskop

Eine detaillierte Beschreibung jedes einzelnen Teils sowie die Stückliste (BOM) finden Leser im Erweiterten Material (Supplementary Notes 1), sie ist im GitHub-Repository unter http://github.com/bionanoimaging/UC2-GIT verfügbar. Im Allgemeinen werden alle Komponenten der UC2-Toolbox mit gängiger CAD-Software (Autodesk Inventor 2019, MA, USA; OpenSCAD 2019.05) konstruiert und mit handelsüblichen FDM-basierten 3D-Druckern (Prusa i3, MK3s, Tschechische Republik; Ultimaker 2+/3, Niederlande) gedruckt, wobei in allen Fällen, mit Ausnahme der Z-Stufe und der Grundplatte, PLA (Tprint = 215 °C) als Druckfaden verwendet wurde. Die Füllung wurde zwischen 20 –40 % gewählt, zusammen mit einer Schichthöhe von 0,15 mm, die eine ausreichend hohe Präzision und Stabilität für volloptische Aufbauten bot. Der monolithisch bedruckte Z-Stufen-Würfel (ergänzende Anmerkungen 7.1) auf Basis einer linear- oder biegegelagerten und horizontal montierten Grundplatte für den Einsatz im Inkubator wurde mit ABS bedruckt, was eine bessere Langzeitstabilität bei Tincubator = 37 ° ergab. Die Z-Stufe passt sich an übliche Objektivlinsen (d. h. RMS-Gewinde) an, die mit Hilfe eines Schneckenantriebs, der mit einer M3-Schraube und Mutter realisiert ist und von einem kostengünstigen Schrittmotor (28BYJ-48, China) angetrieben wird, linear verschoben werden. 

Das schwarze Material wurde in den meisten Fällen zur Reduzierung von Streulicht oder unerwünschter Reflexion und Streuung verwendet. Um die gedruckten Teile zu dekontaminieren, wurden die zusammengesetzten Würfel mit 70%-igem Ethanol besprüht, bevor sie in die Einrichtung des Live-Cell-Imaging-Labors (LSB2, UKJ Jena) gebracht wurden.

Für den magnetischen Arretiermechanismus wurden 5 mm Neodym-Kugelmagnete in die bedruckte Grundplatte eingepresst, die sich an verzinkte Zylinderschrauben M3 × 12 mm (Würth M3 × 12, ISO 4762/DIN 912) anpassten, die in jeder Seite des Würfels sitzen, um eine stabile Verbindung zu gewährleisten. Zusätzliche Drähte, die zu den Magneten bzw. Schrauben hinzugefügt wurden, tragen elektro-optische Module (z.B. LED-Array) mit elektrischer Spannung (d.h. 5V, GND), wobei ein Gleichrichter Probleme mit falscher Polarität verhinderte.

Um das optische Design einfach und kompakt zu halten, setzte man auf eine preiswerte (15 Euro) unendlich korrigierte Objektivlinse (×10, NA = 0,3, China), bei der der Lichtstrahl mit Hilfe eines kosmetischen Spiegels (20 Cent) gefaltet wurde. Das Bild, das bei einer reduzierten Röhrenlänge (dtube = 100 mm) entstand, wurde mit einem hintergrundbeleuchteten CMOS-Sensor (Raspberry Pi Camera, v2.1, UK) aufgenommen, der mit einem Raspberry Pi v3B verbunden war. Ein zusätzliches Modul, das ein Paar motorgetriebene, kostengünstige XY-Mikrotische (3 Euro, dx = dy = ±1,2 mm, Aliexpress, China) zur präzisen Positionierung der Probe in XY (ergänzende Anmerkungen 7.1)

enthält, kann verwendet werden. Für die Hellfeld- und quantitative Bildgebung verwendete man ein 8 × 8 LED-Array (Adafruit #1487, NY, USA), bei dem ein GUI auf einem 7-Zoll-Touchscreen (Raspberry Pi, UK) betrieben wurde, das es erlaubte, die LEDs einzeln zu aktivieren, um den Kontrast nach Siedentopfs Prinzip zu maximieren [41]. Für die Fluoreszenzbildgebung von GFP-markierten HPMEC-Zellen haben wir das Fluoreszenzmodul (ergänzende Anmerkungen 7.1) mit zwei Hochleistungs-LEDs in Dunkelfeldkonfiguration (Cree, 450 nm/405 nm ± 20 nm) ausgestattet und einen Gel-Farbfilter vor dem CMOS-Sensor (ROSCO #11) hinzugefügt. Detaillierte Informationen über den UC2-ISM sind in den ergänzenden Anmerkungen 7.9 zu finden.

Hardware-Synchronisierung und Bilderfassung

Alle Quellen zusammen mit der vollständigen Dokumentation der Software, die unten kurz beschrieben wird, sowie einer detaillierten Anleitung findet sich in unserem GitHub-Repository und in den ergänzenden Anmerkungen 6.1. Eine Reduzierung der Anzahl der Drähte für „aktive“ Module (z. B. ausgestattet mit Motoren, LEDs) wurde durch einen Mikrocontroller erreicht, der an einen verdrahteten I2C-BUS (Arduino Nano, Italien) oder ein drahtloses, auf dem MQTT-Protokoll basierendes (ESP32 WROOM, China) Netzwerk angeschlossen wurde. Als Master-Gerät für die 4-adrige I2C-Verbindung wählte man den Rasp-berry Pi v3B. Das ESP32 kann mit jedem MQTT-Gerät gesteuert werden, z. B. Raspberry Pi, Mobiltelefon oder anderen ESP32/Arduino-Mikrocontrollern im gleichen Netzwerk, was eine Fernsteuerung des Geräts (z. B. vom Büro aus) ermöglicht.

Eine benutzerfreundliche Python-basierte [47] -GUI, die auf einem 7-Zoll-Touchscreen läuft, ermöglicht den Zugriff auf Funktionen wie die Planung von Experimenten, das Einrichten von Bildgebungsmodalitäten (z. B. Beleuchtungsmuster) und die Hardware-/Rahmensynchronisation für verschiedene Anwendungen (z. B. Mikroskop in einem Inkubator). Bilder aus dem Kameramodul (Raspberry Pi, v2.1) werden als komprimierte JPEG-Bilder gespeichert, um Speicherplatz zu sparen oder die nicht verarbeiteten RAW-Bayer-Musterdaten in EXIF-Metadaten schreiben zu lassen. In Fällen, in denen Mobiltelefone (z.B. P9/P20 Pro, Huawei, China) als Bildgebungsgeräte verwendet wurden, wurde die Open-Source-Kamera APP FreeDCam [48] verwendet, um die volle Kontrolle über die Bildgebungsparameter (d. h. ISO, Belichtungszeit) und den Zugriff auf die RAW-Bilder zu haben. USB-Batterien (Stromspeicher) ermöglichten den autonomen Betrieb in ländlichen Gebieten über mehrere Tage.

Getestet wurde die Live-Drift-Korrektur, um die Ausdehnung des Materials durch softwarebasierten Autofokus (d. h. axiale Defokussierung) zu berücksichtigen. Als Fokussierungsmetrik verwendete man einen direkten räumlichen Filter (d. h. Tennengrad) [49] und einen Varianz-basierten Filter als Bildschärfemetrik (ergänzende Anmerkungen 7.3)

Bildanalyse und Bildverarbeitung

Ein angepasstes Python-Skript [47] verarbeitet Langzeitmessungen (z. B. ein Frame pro Minute über 1 Woche), indem es die RAW-Daten in Binning speichert und ein Vorschauvideo erstellt. Dann werden manuell ein Bezugsrahmen, in dem sich die seitliche Probenverschiebung anscheinend beruhigt hat, und ROI (Regions of Interest) für feste Bildmerkmale – hier: Schmutz auf dem Sensor – definiert. In einer zweiten Iteration werden Bildstatistiken wie Min., Max., Mittelwert oder Bildschärfe und Verschiebung unter Verwendung einer Kreuzkorrelationsschätzung für das gesamte Bild und die ROIs in Bezug auf den Bezugsrahmen berechnet. ABS, das einen großen linearen Wärmeausdehnungskoeffizienten von 70 × 10-6/K50 hat, neigt dazu, sich während der einstündigen Aufheizphase im Inkubator besonders dominant zu verformen. Dunkle und beschädigte Bilder wurden mit Hilfe der statistischen Maßnahmen ausgeschlossen. Zur Kompensation der XY-Drift wurden Verschiebungen angewandt und ein Bildstapel-Mittelwert für den grünen Kanal berechnet. Nur der grüne Kanal wurde weiterverarbeitet. Flat-Fielding und Schmutzkorrektur wurden durch Division durch den Mittelwert des gesamten Stapels nach der Hintergrundkorrektur erreicht, um ungleiche Beleuchtung und Sensor-Fehler (z.B. Schmutz, Kratzer) zu berücksichtigen. Fiji (v1.53c46) wurde für die Messung der Zellgröße (d. h. Makrophagen, siehe ergänzende Abb. 2) verwendet, der Durchmesser wurde manuell über 10 Zeitrahmen über die gesamte 1-Wochen-Messung aller vier Mikroskope bestimmt. In jedem Frame wurde eine einzelne Zelle manuell ausgewählt, bevor der Rundheitsfaktor mit einem angepassten Makro berechnet wurde.

Für die aufgabenspezifische Bildverarbeitung direkt auf dem Mobiltelefon, wie z. B. die Verarbeitung der ISM-Messungen oder die Rahmensegmentierung, verwendete man das cloudbasierte Bildverarbeitungs-Framework ImJoy (v0.11.1545), das auf dem GitHub-Repository (ergänz. Anm. 6.1) verfügbar ist. 

Für die quantitativen Phasenmessungen auf der Grund- lage des aIDT wurde der öffentlich zugänglichen Matlab (2017b, The MathWorks, MA, USA) Code von Li et al. [43] mit kleinen Modifikationen entsprechend dem optischen System unter Verwendung des Mobiltelefonmikroskops (siehe ergänz. Anm. 7.6) eingesetzt. 

Mögliche Fluktuationen von Z-Stapeln, die mit dem Lichtblattmikroskop aufgenommen wurden, wurden mit einer auf Kreuzkorrelation basierenden Routine registriert, bevor eine Dekonvolution auf der Grundlage des öffentlich zugänglichen Programms „GenericDeconvolution“ von Heintzmann et al. (erhältlich auf Anfrage) die Unschärfe entfernte.

Probenpräparation

Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden aus Blut, das von gesunden freiwilligen erwachsenen Spendern gespendet wurde, durch Ficoll-Dichtezentrifugation isoliert. Die Studie und die dabei verwendeten experimentellen Protokolle wurden von der Ethikkommission des Universitätsklinikums Jena genehmigt (zugewiesene Studiennummer 2018-1052-BO). In kurzer Zeit wurde Blut mit Isopuffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS ohne Ca/Mg (Gibco, Darmstadt, Deutschland), 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland), 0,1% Rinderserumalbumin (BSA, Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland)) gemischt und auf Biocoll (Biochrom, Merck, Deutschland) ohne Mischen in einem 50 ml-Röhrchen aufgetragen. Biocoll und Blut wurden bei 800 × g für 20 Minuten ohne Pausen zentrifugiert. PBMCs wurden in ein neues 50-ml-Röhrchen überführt und zweimal mit Isopuffer gewaschen. PBMCs wurden in einer Dichte von 1× 106 Zellen/cm2 in X-Vivo 15-Medium (Lonza, Köln, Deutschland) ausgesät, ergänzt mit 10% (v/v) autologem Humanserum, 10 ng/ml Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) und 10 ng/ml Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) (PeproTech, Hamburg, Deutschland) und Pen/Strep (Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland). Nach 1 h wurden die PBMCs zweimal mit Gibco RPMI 1640-Medium (Thermofisher, MA, USA) gewaschen, und die verbleibenden Monozyten wurden dann mit X-Vivo mit Supplementen gespült. 16 h nach der Isolierung wurden die Monozyten mit vorgewärmtem (PBS, ohne Ca/Mg) gewaschen und 7 min mit vorgewärmtem mit 4 mg/ml Lidocain (Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland) und 1 mM EDTA inkubiert. Abgetrennte Monozyten wurden in ein 15-ml-Röhrchen gegeben und 7 min mit 350 × g zentrifugiert. Die Sedimentmonozyten wurden gezählt und 1,5 × 105 wurden in eine 35-mm-Schale ausgesät und mit 3 ml X-Vivo 15 mit Supplementen gespült. .

Danksagungen

Unterstützt wurde diese Studie durch das Zentrum für Sepsiskontrolle und -versorgung (Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), Deutschland, FKZ 01EO1502) und den Leibniz ScienceCampus InfektoOptik Jena, der aus der Förderlinie Strategische Vernetzung der Leibniz-Gemeinschaft finanziert wird. Zusätzlich wurde diese Arbeit von der Deutschen Forschungsgemeinschaft über den Exzellenzcluster „Balance of the Microverse“ im Rahmen der Exzellenzstrategie-EXC 2051-Project-ID 690 390713860 und von der Europäischen Kommission über Marie Skłodowska-Curie Actions (MSCA) Innovative Training Network EUROoC (Grant-Nr. 812954) an A.S.M. finanziell unterstützt. Die Autoren danken der Lichtwerkstatt Jena-Open Photonics Makerspace an der Friedrich-Schiller-Universität Jena für die gemeinsame Nutzung von Ressourcen und Einrichtungen für mehrere Workshops. Außerdem dem Leibniz IPHT Jena e.V. für die Finanzierung des Projektes durch den Innovationsfonds. Menschliche pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen, transfiziert mit eGFP (HPMEC-eGFP), freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Lothar Koch und Andrea Deiwick vom Institut für Quantenoptik der Leibniz Universität. Die Autoren danken Nora Mosig, Melanie Ulrich und Tobias Vogt für ihre hervorragende technische Unterstützung. Ebenso Kaspar Podgorski für die Ausrichtung und dem HHMI Janelia für die Finanzierung des UC2-Workshops auf den HHMI Janelia Research Farms. Gedankt wird auch Xian Hu (Edna), Kay Schink, Felix Margadant und Oddmund Bakke für die Organisation, Finanzierung, Ausrichtung und Vorbereitung von Drosophila- und MDCK-Proben für den Workshop an der Universität Oslo. Für die Bereitstellung der Zebrafischproben wird Dr. Uta Naumann vom Leibniz-Institut für Alterung - Fritz-Lipmann-Institut (FLI) Jena gedankt. Darüber hinaus auch Philipp Kahn für die Erstellung der UC2-Projektwebseite, Eda Bingöl für die Unterstützung bei den Dreharbeiten und witelo Jena e.V. für die Ausrichtung mehrerer UC2-Workshops. Die Autoren danken Ronny Förster, Tomáš Čižmár, Nico Schramma und Kyriacos Leptos für die fruchtbaren Diskussionen. Weiterer Dank geht an Øystein Helle von der Arktischen Universität Tromsø für die Vorbereitung und Patrick Then für seine Hilfe bei der Bildgebung der E. coli-Bakterien. R.H. dankt für die Unterstützung durch den von der Deutschen Forschungsgemeinschaft geförderten Sonderforschungsbereich SFB 1278 (PolyTarget, Projekt C04).

Beiträge:

B.D., R.L. und S.C. konzipierten die UC2-Idee, B.D., R.L., S.C., B.M., R.H. und H.W. führten die Datenkuration durch, B.D., R.L. und S.C. trugen zur formalen Analyse bei, B.D., B.M. und H.W. entwickelten Hardwarekomponenten, B.D., R.L. und X.U. entwickelten die Erfassungssoftware, B.D., R.L., A.M. und R.H. organisierten die Beschaffung von Finanzmitteln, B.D., R.H. und R.L. überwachten, konzipierten und planten das Projekt, entwarfen das Instrument, interpretierten die Daten und schrieben das Manuskript. Alle Autoren lasen und genehmigten das endgültige Manuskript. Namenskürzel siehe „Autoren“.

Dies ist eine Übersetzung des Originalartikels in zwei Teilen in Nature Communications volume 11, Article number: 5979 (2020), publiziert unter creative commons licence CC-BY 4.0 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 

Ergänzende Anmerkungen und Videos sind unter https://www.nature.com/articles/s41467-020-19447-9 zu finden.

DIE AUTOREN

Benedict Diederich (B.D.) 1, 2, 3 ,
René Lachmann (R. L.) 1 , Swen Carlstedt (S. C.) 4 ,
Barbora Marsikova (B. M.) 1, 3 Haoran Wang (H. W.) 1 ,
Xavier Uwurukundo (X. U.) 1
Alexander S. Mosig (A. M.) 4 ,
Rainer Heintzmann (R. H.) 1, 2, 3

1 Leibniz Institute of Photonic Technology, Albert-Einstein-Strasse 9, 07745, Jena, Germany
2 Institute of Physical Chemistry and Abbe Center of Photonics, Helmholtzweg 4, Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany
3 Faculty of Physics and Astronomy, Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany
4 Jena University Hospital, Institute of Biochemistry II, Am Klinikum 1, Jena, Germany

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Weitere Informationen

  • Ausgabe: 2
  • Jahr: 2021
  • Autoren: Benedict Diederich (B.D.) 1, 2, 3 , René Lachmann (R. L.) 1 , Swen Carlstedt (S. C.) 4 , Barbora Marsikova (B. M.) 1, 3 Haoran Wang (H. W.) 1 , Xavier Uwurukundo (X. U.) 1 Alexander S. Mosig (A. M.) 4 , Rainer Heintzmann (R. H.) 1, 2, 3 1 Leibniz Institute of Photonic Technology, Albert-Einstein-Strasse 9, 07745, Jena, Germany 2 Institute of Physical Chemistry and Abbe Center of Photonics, Helmholtzweg 4, Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany3 Faculty of Physics and Astronomy, Friedrich-Schiller-University, Jena, Germany 4 Jena University Hospital, Institute of Biochemistry II, Am Klinikum 1, Jena, Germany

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