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Dienstag, 14 März 2023 10:59

Hydroxylapatit-Beschichtungen für 3D-gedruckte Gesichtsimplantate

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Geschätzte Lesezeit: 9 - 17 Minuten

Implantate für den Gesichtsbereich ermöglichen die chirurgische Korrektur von Deformationen z. B. nach Unfällen. Derzeit kommen KunststoffImplantate zur Anwendung, die nicht auf die Anatomie des Patienten abgestimmt sind und erst während der Operation angepasst werden. Oftmals ungenügende Verankerung am Knochen birgt Risiken von Verschiebungen und damit Entstellungen sowie bakteriellen Infektionsrisiken. Entwicklungsziel für temperatursensitive, auch 3D-druckbare Polymere, waren daher antimikrobielle Beschichtungen für optimales Knochenwachstum mittels Atmosphärendruck-Plasmaspritzen von Hydroxylapatit (HAp). Letzter Teil des Zweiteilers.

Abb. 4: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zur (a) Morphologie des Pulvers und (b) zur Querschnittsstruktur der Schichten  nach Bruch des Urethan-Acrylat-Substrats, die braunen Bereiche sind dabei dem Substrat zuzuordnen; (c) Oberflächentopographie der  abgeschiedenen SchichtenAbb. 4: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zur (a) Morphologie des Pulvers und (b) zur Querschnittsstruktur der Schichten nach Bruch des Urethan-Acrylat-Substrats, die braunen Bereiche sind dabei dem Substrat zuzuordnen; (c) Oberflächentopographie der abgeschiedenen SchichtenIn den durchgeführten Versuchen mit Atmosphärendruck-Plasmaspritzen wurde speziell auf niedrige Temperaturbelastung der Substrate geachtet. Zwischen den vorgewählten 3 bzw. 5 Überfahrten mit dem IC3-Plasmajet, welche zu 17.5 bzw. 31 µm mittlerer Schichtdicke auf den Urethan-Acrylat-Substraten führten, wurden ausreichend lange Zwischenkühlzeiten geplant. Abbildung 4 zeigt die erzielten Schichtstrukturen im Querschnitt (mit energiedispersivem Element-Mapping (EDX)) sowie die Oberflächentopographien der beiden Schichttypen. Im Vergleich ist auch auch ein Bild des Ausgangspulvers mit 25 µm durchschnittlicher Korngröße und etwas spratziger Morphologie dargestellt. In den Oberflächenbildern ist zu erkennen, dass es kaum zu einer Änderung der Korngröße des abgeschiedenen HAp kommt. Die spratzige Oberflächenmorphologie verstärkt sich teilweise. Andererseits treten aber auch wenige glatte HAp-Bereiche auf, die auf ein lokales Aufschmelzen einzelner Pulverkörner hinweisen. Auch sind einige sphärisch erstarrte Tröpfchen erkennbar. Letzterer Strukturtyp ist leicht verstärkt bei den mit 5 Überfahrten beschichteten Proben zu erkennen, was auf höhere Oberflächentemperatur bei der Abscheidung oder schlechtere Wärmeleitung durch die vorher abgeschiedenen Schichtlagen hinweist. Auch die Rauigkeiten (gemessen mit Mitutoyo SJ-210-Tastschnittgerät) nehmen von Ra 1.6 µm beim unbeschichteten Urethan-Acrylat auf 3.9 µm nach 3 Überfahrten bzw. 4.2 µm nach 5 Überfahrten zu (Rz: 1.9 µm auf 4.5 µm und 5.5 µm). Bei der dickeren Schicht mit 5 Überfahrten sind zudem einige Risse durch die Schicht hindurch zum Substrat erkennbar. Diese sind bedingt durch intrinsische thermische Spannungen bei der Abkühlung (Abschreckung) der Proben nach dem Auftrag.

Die sehr gute Anhaftung der Schicht ist Abbildung 4b für die Versuche mit 5 Überfahrten zu entnehmen: Da trotz Kühlung kein vollständig spröder Zustand des Polymersubstrats erreicht werden konnte und damit starke plastische Oberflächenverformung auftrat, liegt die Schicht für das Bild mit 5 Überfahrten (5 ÜF) fragmentiert vor, löste sich in den Bereichen zwischen den Fragmenten aber nicht ab.

Eine chemische Analyse der Beschichtungen, durchgeführt mittels energiedispersiver Spektroskopie in Flächenmappings am Rasterelektronenmikroskop, zeigt keine signifikanten Abweichungen zwischen Schicht- und Pulverzusammensetzung. Diese wurden durch Entfernung von verfälschendem Kohlenstoff des Polymersubstrats bzw. des Fixierungsklebebands für die Analyse des Pulvers korrigiert. Es kommt daher nur zu sehr geringer Oxidation durch die Prozessführung in das Plasma umgebender Luftatmosphäre bzw. nach Schichtabscheidung während der Abkühlphase an der Schichtoberfläche. Das Plasma selbst wird durch Entladung in Ar gebildet, das HAp-Pulver mit Stickstoff aus dem Rütteldosierer heraus gefördert.

Ziel der Röntgenbeugungs-Untersuchungen war die röntgenographische Bestimmung der bei den Schicht-Proben auftretenden Phasen (qualitative Analyse) (Abb. 5). Für das HAp-Pulver und die beiden Schichten mit 3 und 5 Überfahrten wurde stets die kristalline Phase Hydroxylapatit gefunden (ICDD-PDF 01-089-6437, lt. Datenbankeintrag mit Formel Ca10.042(PO4)5.952(OH)2.292). Das Beugungsmuster der kristallinen Hydroxylapatit-Phase erklärt alle auftretenden Beugungsmaxima. In allen Proben können darüber hinaus die breiten amorphen „Buckel“ des Substrates erkannt werden. Das Substrat selbst zeigt keine Beugungsreflexe einer kristallinen Phase. Die Diffraktogramme von Proben mit 3 und 5 Überfahrten sind sehr ähnlich, die Unterschiede (hauptsächlich der Intensität des Substratanteiles) hängen mit den unterschiedlichen Absorptionseigenschaften (Schichtdicken) zusammen. Schlussendlich konnten keine Variationen der Gitterkonstanten hinsichtlich mit bzw. ohne Plasmanachbehandlung festgestellt werden.

Abb. 5: Röntgendiffraktometrie-Untersuchung (XRD) in  konventioneller Bragg-Brentano-Geometrie der mit 3 und  5 Überfahrten hergestellten HAp-Schichten (mit Zuordnung  der vorgeschlagenen Phase) im Vergleich zum amorphen  Urethan-Acrylat-Substrat und dem HAp-Ausgangspulver   Abb. 5: Röntgendiffraktometrie-Untersuchung (XRD) in konventioneller Bragg-Brentano-Geometrie der mit 3 und 5 Überfahrten hergestellten HAp-Schichten (mit Zuordnung der vorgeschlagenen Phase) im Vergleich zum amorphen Urethan-Acrylat-Substrat und dem HAp-Ausgangspulver

Als Vorbereitung der in vitro Biokompatibilitäts- und mikrobiologischen Tests wurden die Proben mittels Ethylenoxid-Begasung sterilisiert.

Angelehnt an die ISO 10993-5 (Biologische Beurteilung von Medizinprodukten Teil 5: Prüfen auf In-vitro Zytotoxizität) wurden Zellen auf das zu prüfende Material angesiedelt und der zytotoxische Einfluss bestimmt. Zur Testung der Materialien wurden Ultra-Low-Attachment Plates verwendet. Dies stellte sicher, dass die Zellen bei der Besiedelung nur am Plättchen haften blieben und nicht an der umliegenden Kulturfläche. Dafür wurden die Proben in eine 24-Lochplatte (Ultra-Low-Attachment-Plate) eingelegt. Glasplättchen mit vergleichbarem Durchmesser wurden als Kontrollkultur mitgeführt. Zudem wurde eine zweite Kontrollkultur, bei welcher die Zellen mit Zinksulfat behandelt wurden, mitgeführt, welches einen zytotoxischen Effekt hervorruft. Es erfolgte die Besiedelung der Plättchen mit MC3T3-E1 Zellen in einer Dichte von 5x104 Zellen pro Vertiefung (Well) in 2 ml Kulturmedium. Das Kulturmedium bestand aus Dulbecco’s Modified Eagle Medium (high Glucose; Fa. Gibco, Cat.Nr. D6429) mit 10 % Fötalem Kälberserum (FBS; Fa. Gibco, Cat.Nr. 10270) und 100 U/ml Penicillin und 100µg/ml Streptomycin (Fa. Gibco, Cat.Nr. 15140). Nach 24 Stunden Inkubation wurde die Proliferation eines auf Resazurin basierenden Farbstoffes (PrestoBlue) gemessen. Eine wässrige Resazurinlösung wird von normal arbeitenden Zellen allmählich zu Resorufin reduziert. Zytotoxische Stoffe senken diese metabolische Aktivität und das Redoxpotential der Zelle, was je nach toxischer Wirksamkeit zum Verlangsamen oder Beenden der Reduktion des Resazurins führt. Die Bestimmung erfolgt mittels fluorometrischer Messung des Farbstoffes. Die Proliferation der auf dem zu testenden Material befindlichen Zellen wurde anschließend jenen Zellen der Kontrolle(n) gegenübergestellt. Eine Zytotoxizität liegt vor, wenn die Viabilität der Zellen auf dem getesteten Material, im Vergleich zur Kontrolle, unter 70 % fällt, was nur für die Positivkontrolle (Low Attachement Plates) gemessen wurde. Die Zellviabilität auf den Beschichtungen liegt bei ~220 %, jene auf dem Substrats bei ~160 % bezogen auf die Negativkontrolle (Glasplättchen, 100 %).

Abb. 6: REM-Aufnahmen nach den Zytotoxizitätstests (direkter Kontakt mit Osteoblast-Zellen)Abb. 6: REM-Aufnahmen nach den Zytotoxizitätstests (direkter Kontakt mit Osteoblast-Zellen)Parallel zu den Ansätzen für die Bestimmung der Zytotoxizität, wurden zusätzlich Plättchen mit Osteoblastzellen besiedelt. Nach 24 Stunden wurden diese fixiert, entwässert und im Elektronenmikroskop auf ihre Morphologie untersucht (Abb. 6). Die Fixierung erfolgte wegen einer Wechselwirkung mit dem Substrat nicht mit Phosphat gepufferter Glutaraldehyd-Lösung sondern mit auf Phosphat gepufferte Formaldehyd-Lösung.

Die Morphologie der Zellen blieb bei den beschichteten Proben eher erhalten als auf dem Urethan-Acrylat-Substrat (Referenz). Während die Zellen auf dieser Referenz rundlich und wenig adhärent erscheinen, breiten diese sich mehr auf dem HAp-beschichteten Material aus und ähneln in ihrer Form und Größe den auf den Glasplättchen (als negative Kontrolle) kultivierten Zellen. Auf dem unbeschichteten Referenzmaterial ähnelten die Zellen in ihrer Morphologie ebenfalls den der Glasplättchen. Keine der beschichteten getesteten Materialien zeigen einen zytotoxischen Einfluss auf die Zellen, wobei auf den unbeschichteten Substraten die Viabilität der Zellen deutlich abnimmt, aber nicht unter 70 % sinkt. Dies wird auch in den elektronenmikroskopischen Untersuchungen ersichtlich, da die auf den Referenzmaterialien angesiedelten Zellen keine für die Zellen typische Morphologie besitzen.

Der Kontakttest der antimikrobiellen Aktivität wurde auf der Grundlage von ISO 22196:2007(E) durchgeführt. Wie in der Norm empfohlen, wurden Escherichia coli Bakterien (Stamm ATCC 8739, gramnegativ) und Staphylococcus aureus Bakterien (Stamm 6538P, grampositiv) verwendet, welche jeweils in einer Menge von 107 Spezies zugegebenen wurden. Die Testung erfolgte unter einer Abdeckung aus Kunststofffolie in einem sehr eingeschränkten Flüssigkeitsvolumen, welche die in vivo Vorgänge simuliert. Die erzielten Ergebnisse – unter Anwendung von metallischen TiAl6V4-Substraten – wurden in Tabelle 1 als antibakterieller Aktivitätsindex (R) dargestellt, der den Unterschied zwischen der Anzahl der lebensfähigen Bakterien darstellt, die aus den unbehandelten und behandelten Proben gewonnen wurden. Ein Material weist antibakterielle Eigenschaften auf, wenn der berechnete R-Wert größer als 2 (Größenordnung, entspricht 99 % Reduktion an Bakterien) ist. Je höher der R-Index ist, desto besser sind die antibakteriellen Eigenschaften. Gut zu erkennen ist, dass die nicht mit weiteren antimikrobiellen Wirkstoffe (z. B. Silber, Kupfer, Zink) dotierten, reinen HAp-Beschichtungen bereits einen R-Index von > 5 bzw. > 6 gegen Escherichia coli und Staphylococcus aureus besitzen. Messungen mit nicht-geglühten und geglühten Substraten (d. h. Glühung vor der HAp-Beschichtung, welche nur die Oberflächenchemie des Substrats verändert) bestätigen die Reproduzierbarkeit der Beschichtung.

Tab. 1: Antibakterieller Aktivitätsindex für die beiden nach ISO 22196:2007E getesteten Stämme Escherichia coli (ATCC 8739) und Staphylococcus aureus (6539P). Ausgangskonzentration an Bakterien im 24h-Test war eine Menge von 107 Spezies, wobei die Versuchsdurchführung unter Kunststofffolie im eingeschränkten Volumen erfolgte 

R (log)

Escherichia coli (strain ATCC 8739)

Staphylococcus aureus (strain 6538P)

TiAl6V4

0,4

2,6

TiAl6V4 mit HAp (5 ÜF)

5,2

6,4

TiAl6V4 (geglüht)

0,4

6,5

TiAl6V4 (geglüht) mit HAp (5 ÜF)

5,2

6,4

Nicht auf die direkte antimikrobielle Aktivität im Kontakt sondern auf die Wirkung auf umgebende wässrige Lösungen abzielende Immersionstests wurden im Anschluss durchgeführt. Dabei erfolgte keine Abdeckung der auf die Probenoberflächen aufgebrachten Bakterien mit Kunststofffolie, wodurch frei bewegliche Bakterien vorliegen. Hier zeigen sich aufgrund des beabsichtigten schlechten Lösungsverhaltens des HAp nur sehr geringe Auswirkungen auf antimikrobielle Eigenschaften vor allem an der Oberfläche („Biofilm“), welche jedoch immer noch besser als für die unbeschichteten Substrate (TiAl6V4) sind. Die Anzahl der „colony forming units“ konnte leicht verringert werden, während diese im Medium anstieg.

Zusammenfassung

Ziel der vorgestellten Arbeiten war die Entwicklung von Beschichtungen für zukünftige patientenspezifisch angepasste Gesichtsimplantate aus 3D-Druck-Polymeren mit niedriger thermischer Beständigkeit, wobei die chirurgischen Erwartungen durch eine bioaktive Beschichtung aus Hydroxylapatit (HAp) zur optimalen Verbindung mit dem umliegenden Knochen und für einen antimikrobiellen Grundschutz erfüllt werden konnten. Die Beschichtung kann mittels Atmosphärendruck-Plasmaspritzen mit dem innovativen Plasmajet von Inocon Technologie GmbH auf sowohl glatte als auch strukturierte Oberflächen sowie auf poröse Materialien aufgebracht werden, d. h. z. B. biomimetisch mit „Nischen“ für optimale Adhäsion von Knochenzellen (Osteoblasten) gestaltete Implantate. Der niedrige und über einen digitalen Zwilling auch gut simulierbare Temperatureintrag in die Partikel ermöglicht die Ausbildung gleicher chemischer und struktureller Eigenschaften der Beschichtung, wie diese vom medizinisch zugelassenen HAp-Ausgangspulver bekannt sind. Zusätzlich kann keine Schädigung des Polymers (angewendet wurde ein 3D-Druck-Polymer auf Basis Urethan-Acrylat, aber in weiteren Versuchen auch Polyetheretherketon, Polyetherketonketon und Polycaprolactan) sowie sehr gute Haftung nachgewiesen werden. Auch die Anwendung auf filigranen Titan-Oberflächen ist möglich. Die Biokompatibilitätstests zeigten keine Zytotoxizität sowie durch die bioaktive Struktur ein starkes Zellwachstum von Knochenzellen (Osteoblasten). Auch konnte ein sehr guter antimikrobieller Effekt im direkten Kontakt ohne Zugabe von zusätzlichen antimikrobiellen Wirkstoffen nachgewiesen werden. Derzeit wird eine in vivo Studie am Tiermodell durchgeführt, um basierend auf diesen Ergebnissen eine Technologieskalierung für den Einsatz auf Implantaten zu initiieren.

Dank gilt dem Fördergeber des Projekts „safeFACEimplant“ in der Initiative BRIDGE Young Scientists sowie dem transnationalen M.ERA-NET-Projekts „fingerIMPLANT“ speziell in Österreich, d. h. der Österreichischen Forschungsförderungs Ges.m.b.H. (FFG).

Literatur

Auch für Teil 1, Galvanotechnik 1/2023. S. 98-103

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Weitere Informationen

  • Ausgabe: 2
  • Jahr: 2023
  • Autoren: Jürgen M. Lackner; Dietmar F. Kopp; Wolfgang Waldhauser; Reinhard Kaindl; Andreas Hinterer; Maximillian Stummer; Felix Spiess; Bernd Prettenthaler; Günter Russmüller; Barbara Kapeller; Roman Major

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