La microfluídica ofrece la posibilidad de ejecutar reacciones complejas en apenas unos centímetros cuadrados. A continuación se resumen ejemplos de la investigación actual.
Universidad Médica de Viena: método para secuenciar millones de células individuales [1].
La secuenciación del ARN es una tecnología importante para la investigación de células y enfermedades. En particular, la secuenciación de células individuales permite descubrir la heterogeneidad y diversidad de nuestro organismo. Es la tecnología central del "Human Cell Atlas" para cartografiar todas las células humanas. Sin embargo, el método alcanza sus límites en proyectos muy grandes, ya que requiere mucho tiempo y es muy caro. Científicos del grupo de investigación de Christoph Bock, del Centro de Investigación de Medicina Molecular CeMM de la Academia Austriaca de Ciencias y profesor de la Universidad Médica de Viena, han desarrollado un nuevo método para secuenciar grandes cantidades de células individuales de forma más sencilla y rentable [2].
La investigación de las células es una base importante para el desarrollo de la medicina personalizada. Hace cinco años, científicos de todo el mundo lanzaron el proyecto "Atlas Celular Humano" con el objetivo de catalogar todas las células del cuerpo humano. Estos datos han ayudado, por ejemplo, a identificar muy rápidamente los tipos de células que el coronavirus puede infectar especialmente bien.
Gotas de emulsión de un experimento scifi-RNA-seq cargadas con un múltiplo de células (Foto: Paul Datlinger, CeMM)Para acelerar y mejorar la creación de tales catálogos celulares, Paul Datlinger y André F. Rendeiro, del grupo de investigación de Christoph Bock en el CeMM, desarrollaron un método para leer simultáneamente la actividad de los genes en un gran número de células individuales. Este método, denominado "scifi-RNA-seq" (de "single-cell combinatorial fluidic indexing"), marca por adelantado el ARN de muchas células con códigos de barras antes de que las células se disuelvan en un chip microfluídico y su ARN se prepare para la secuenciación unicelular. Estos códigos de barras superan un problema importante de los métodos existentes para la secuenciación unicelular.
El método utilizado hasta la fecha se enfrenta al reto de que las suspensiones unicelulares sólo pueden cargarse en el chip microfluídico a una concentración muy baja para evitar que dos células acaben en la misma gota de emulsión, lo que daría lugar a un perfil celular distorsionado. Por tanto, la mayoría de las gotas de emulsión debían permanecer vacías para crear una distancia con las gotas cargadas. Por tanto, los reactivos se utilizaban de forma muy ineficiente.
Al etiquetar las células con varios códigos de barras adicionales en la fase previa, las gotas de emulsión en scifi-RNA-seq pueden cargarse con muchas células al mismo tiempo y seguir analizándose células individuales. Esto ahorra tiempo y costes. En el popular sistema genómico 10x, se pueden analizar 15 veces más células individuales con el nuevo método. Los códigos de barras adicionales también permiten etiquetar y procesar miles de muestras en un único análisis microfluídico. Como parte del estudio, se llevó a cabo un cribado CRISPR con secuenciación unicelular en células T humanas. En el futuro, el método debería ayudar a mejorar, entre otras cosas, las inmunoterapias para el tratamiento del cáncer.
Los proyectos que deseen analizar un gran número de células o un gran número de muestras con secuenciación unicelular se beneficiarán especialmente del nuevo método. Scifi-RNA-seq permite secuenciar eficazmente el ARN de millones de células individuales y simplifica así la caracterización de tejidos complejos, órganos y organismos enteros. También en el campo biomédico suele ser importante analizar simultáneamente un gran número de células individuales, por ejemplo para descubrir poblaciones raras de células madre en tumores o células cancerosas en la sangre. Además, scifi-RNA-seq puede contribuir a que los cribados de fármacos y CRISPR se combinen cada vez más con la secuenciación unicelular de alta resolución.
Fraunhofer IPM: Nuevo método para la detección de moléculas individuales [3]
La resistencia a los antibióticos aumenta constantemente en todo el mundo. Investigadores del Instituto Fraunhofer de Técnicas de Medición Física IPM, junto con la LMU de Múnich, han desarrollado un método para reconocer gérmenes multirresistentes con gran rapidez. La particularidad: basta una sola molécula de ADN para detectar el patógeno. En el futuro, la plataforma se utilizará en el diagnóstico en el punto de atención de las salas de hospital o en las consultas médicas, como alternativa al análisis por PCR o en combinación con otros métodos de diagnóstico.
En el tratamiento de las infecciones bacterianas, el antibiótico adecuado determina el éxito de la terapia. La selección del fármaco adecuado es especialmente difícil cuando la enfermedad está causada por patógenos multirresistentes que son insensibles a muchos antibióticos. La búsqueda del antibiótico más eficaz suele requerir información sobre el genoma de la bacteria. Sin embargo, ésta no suele estar disponible de inmediato en la consulta del médico, sino sólo tras un diagnóstico de laboratorio. Con el fin de acelerar y simplificar el proceso, Fraunhofer IPM colabora con la LMU de Múnich en un proyecto (SiBoF), abreviatura de Signal Booster for Fluorescence Assays in Molecular Diagnostics, para desarrollar una novedosa plataforma de detección de patógenos mediante moléculas individuales en un chip microfluídico. El objetivo es facilitar la detección en el punto de atención (POC). El proyecto está financiado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF).
La plataforma de pruebas, portátil y compacta, cuenta con un sistema fluídico automatizado. Todos los reactivos necesarios se almacenan previamente en el sistema. El chip microfluídico moldeado por inyección se coloca en un cajón del sistema de ensayo, donde el sistema de fluídica le suministra los reactivos antes de que tenga lugar el análisis óptico. En el nuevo método, se detecta parte de la cadena de ADN del patógeno. Para ello basta con una sola molécula de ADN que se una a un punto específico del chip microfluídico. El chip contiene canales fluídicos cuyas superficies se han preparado con sitios de unión para patógenos específicos.
Normalmente, las moléculas de ADN diana se detectan in vitro mediante marcadores fluorescentes específicos. La especialidad del nuevo método desarrollado por Fraunhofer IPM y LMU Munich: Los investigadores utilizan antenas con perlas de tamaño nanométrico que amplifican las señales ópticas de estos marcadores. Esto elimina la necesidad de la amplificación química mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las antenas ópticas consisten en partículas metálicas de tamaño nanométrico que agrupan la luz en un área diminuta y ayudan a emitirla, de forma similar a las antenas macroscópicas con ondas de radio. Estas partículas metálicas están unidas químicamente a la superficie del chip.
Una estructura de moléculas de ADN especialmente construida por la LMU de Múnich, conocida como origami de ADN, mantiene las dos nanopartículas de oro en su sitio. Entre estas nanopartículas, la estructura proporciona un sitio de unión para la molécula diana respectiva y un marcador fluorescente. Este diseño patentado constituye la base de la novedosa tecnología de ensayo. Las partículas, de 100 nanómetros cada una, sirven de antena. En el punto caliente entre las dos partículas de oro se produce una amplificación del campo debido a efectos plasmónicos. Si se coloca allí un colorante fluorescente, la radiación de fluorescencia de onda más larga detectable se amplifica varias veces. De este modo, se puede reconocer una sola molécula con un dispositivo óptico pequeño y compacto. Se pueden detectar concentraciones bajas de agentes patógenos. El resultado está disponible al cabo de sólo una hora y se muestra en el monitor. Esto se aplica no sólo a los gérmenes multirresistentes, sino también a cualquier tipo de molécula de ADN. En principio, el ensayo de molécula única también puede utilizarse para moléculas distintas del ADN, como ARN, anticuerpos/antígenos o enzimas. La funcionalidad del método se ha confirmado con éxito mediante numerosas pruebas.
En el corazón del dispositivo POC se encuentra un microscopio de fluorescencia miniaturizado de alta resolución desarrollado por Fraunhofer IPM. Un software especial de análisis de imágenes identifica las moléculas individuales y permite así contar las moléculas diana capturadas para obtener un resultado cuantitativo. La fluorescencia se estimula mediante LED montados debajo del cartucho con los canales fluídicos. El sistema patentado está disponible como demostrador. En la actualidad aún falta un módulo para la preparación de muestras. El sistema POC para la detección específica de patógenos se presentó en MEDICA 2021 en Düsseldorf.
Bibliografía
[1] Universidad Médica de Viena
[2] Ultra-high-throughput single-cell RNA sequencing and perturbation screening with combinatorial fluidic indexing, Paul Datlinger, André F. Rendeiro, Thorina Boenke, Martin Senekowitsch, Thomas Krausgruber, Daniele Barreca, Christoph Bock; publicado el 31 de mayo de 2021 en Nature Methods, DOI: 10.1038/s41592-021-01153-z
[3] Fraunhofer IPM
